Hĺbkové sekvenovanie bivalentných vakcín Moderna a Pfizer identifikuje kontamináciu expresných vektorov určených na amplifikáciu plazmidov v baktériách

Substack, Anandamide, 16. februára 2023

Feb 21, 2023

Úvod

Keďže univerzity v Spojených štátoch naďalej nariaďujú bezzodpovednostné injekcie (vakcíny proti COVIDu) pre študentov s obmedzeným rizikom nákazy COVIDom, je nevyhnutné, aby bolo k dispozícii viac verejných informácií o zložkách týchto experimentálnych vakcín. EMA aj TGA si všimli fragmentovanú RNA a rozmazané western bloty, ktoré naznačujú, že výrobný proces vakcíny nie je dostatočne verný a transparentný. Krátko po zverejnení údajov TGA uverejnili Patel a kol. (Pfizer) článok, v ktorom sa pokúsili rozptýliť tieto obavy. Jessica Rose sa tejto téme venovala tu.

Informovaný súhlas nemožno získať pri nedostatočne charakterizovaných liečivách.

Teraz vstupujeme do tretieho roka kovidového programu a je čoraz jasnejšie, ktoré demografické skupiny sú ohrozené. Ukázalo sa, že veková skupina študentov (do 25 rokov) má opakovane veľmi nízke riziko COVIDu, avšak nežiaduce účinky vyvolané vakcínou u študentov v tejto vekovej kategórii sú vyššie ako pri akejkoľvek vakcíne, ktorá sa kedy podávala. Krug a kol. pozorovali riziko 1:6250 myo/perikarditídy u 16–17-ročných (Krug a kol.).

Trop Med Infect Dis. 2022 Aug 19;7(8):196. doi: 10.3390/tropicalmed7080196.

Kardiovaskulárne prejavy mRNA BNT162b2

COVID-19 vakcíny u dospievajúcich

PMID: 36006288 PMCID: PMC9414075 DOI: 10.3390/tropicalmed7080196

Abstrakt

Táto štúdia sa zameriava na kardiovaskulárne prejavy, najmä myokarditídu a perikarditídu po injekčnom podaní mRNA vakcíny BNT162b2 proti COVIDu-19 u thajských adolescentov. Do tejto prospektívnej kohortovej štúdie boli zaradení študenti vo veku 13–18 rokov z dvoch škôl, ktorí dostali druhú dávku mRNA vakcíny BNT162b2 proti COVIDu-19. Údaje vrátane demografických údajov, symptómov, vitálnych znakov, EKG, echokardiografie a srdcových enzýmov sa zbierali na začiatku, 3. deň, 7. deň a 14. deň (nepovinne) pomocou formulárov na zaznamenávanie prípadov. Zapísali sme 314 účastníkov; z nich 13 účastníkov bolo stratených z následného sledovania, takže na analýzu zostalo 301 účastníkov. Najčastejšie kardiovaskulárne príznaky a boli tachykardia (7,64%), dýchavičnosť (6,64%), palpitácie (4,32%), bolesť na hrudníku (4,32%) a hypertenzia (3,99%). Jeden účastník mohol mať viac ako jeden príznak a/alebo príznakov. Sedem účastníkov (2,33%) vykazovalo aspoň jeden zvýšený srdcový biomarker alebo pozitívny laboratórnych hodnotení. Kardiovaskulárne prejavy sa vyskytli u 29,24% pacientov, a to v rozmedzí od tachykardie alebo palpitácií až po myoperikarditídu. Myoperikarditída bola potvrdená u jedného pacienta po očkovaní. U dvoch pacientov bolo podozrenie na perikarditídu a u štyroch pacientov bolo podozrenie na subklinickú myokarditídu. Na záver možno konštatovať, že kardiovaskulárne prejavy u dospievajúcich po BNT162b2 mRNA COVID-19 očkovaním zahŕňali tachykardiu, palpitácie a myoperikarditídu. Klinické prejav myoperikarditídy po očkovaní bol zvyčajne mierny a prechodný, pričom všetky prípady sa úplne zotavili do 14 dní. Preto by sa dospievajúci, ktorí dostávajú mRNA vakcíny, mali monitorovať na kardiovaskulárne vedľajšie účinky. Registrácia klinického skúšania: NCT05288231.

Mansanguan et al.

"Thajská štúdia" (Mansanguan et al.) naznačuje ešte vyššiu mieru kardiálneho rizika u študentov, kde sa u 29,24% študentov (n=301) vyskytli kardiovaskulárne prejavy. Štúdie zahŕňajúce 23 miliónov severských pacientov pozorovali významnú mieru myokarditídy aj v tejto vekovej skupine. Táto štúdia, hoci bola väčšia, nebola taká kontrolovaná ako thajská štúdia v tom, že Mansanguan a kol. vykonali základné merania pacientov a skúmali viac ako len myo/perikarditídu.

Tieto riziká sa pri samotnom C19 nepozorujú.

Výskyt myokarditídy a perikarditídy u post COVIDových-19 neočkovaných pacientov - veľká populačná štúdia

PMID: 35456309 PMCID: PMC9025013 DOI: 10.3390/jcm11082219

Abstrakt

Myokarditída a perikarditída sú potenciálne postakútne kardiálne následky infekcie COVIDu-19, ktoré vznikajú v dôsledku adaptívnych imunitných reakcií. Naším cieľom bolo preskúmať výskyt postakútnej myokarditídy a perikarditídy spôsobenej COVIDom-19. Retrospektívna kohortová štúdia 196,992 dospelých po infekcii COVIDu-19 u členov spoločnosti Clalit Health Services v Izraeli v období od marca 2020 do januára 2021. Diagnózy hospitalizovanej myokarditídy a perikarditídy boli získané od 10. dňa po pozitívnej PCR. Sledovanie bolo cenzurované 28. februára 2021 s minimálnou dobou sledovania 18 dní. Kontrolná kohorta 590,976 dospelých s aspoň jednou negatívnou PCR a žiadnou pozitívnou PCR zodpovedala veku a pohlaviu. Keďže izraelský očkovací program sa začal 20. decembra 2020, časová zhoda kontrolnej kohorty sa vypočítala spätne od 15. decembra 2020. U deviatich pacientov po očkovaní vakcínou proti COVIDu-19 sa vyvinula myokarditída (0,0046%) a u jedenástich pacientov bola diagnostikovaná perikarditída (0,0056%). V kontrolnej skupine malo 27 pacientov myokarditídu (0,0046%) a 52 pacientov malo perikarditídu (0,0088%). Vek (upravený pomer rizika [aHR] 0,96, 95% interval spoľahlivosti [Cl]; 0,93 až 1,00) a mužské pohlavie (aHR 4,42; 95% Cl, 1,64 až 11,96) boli spojené s myokarditídou. Mužské pohlavie (aHR 1,93; 95% CI 1,09 až 3,41) a periférne cievne ochorenie (aHR 4,20; 95% CI 1,50 až 11,72) boli spojené s perikarditídou. Infekcia po COVIDe-19 nebola spojená ani s myokarditídou (aHR 1,08; 95% Cl 0,45 až 2,56), ani s perikarditídou (aHR 0,53; 95% CI 0,25 až 1,13). U dospelých pacientov zotavujúcich sa z infekcie COVIDu-19 sme nepozorovali zvýšený výskyt perikarditídy ani myokarditídy.

Kľúčové slová: COVID-19; myokarditída; perikarditída.

Tuvali et al.

Podobné výsledky sú vidieť v Aquaro et al. a Sechi et al. kde sa myokarditída odvodená od C19 nelíši od miery pozadia.

Výskyt akútnej myokarditídy a perikarditídy počas pandémie koronavírusového ochorenia 2019: porovnanie s predpandemickým obdobím

PMID: 35763765 DOI: 10.2459/JCM.0000000000001330

Abstrakt

Východiská: Navrhuje sa, aby myokarditída a perikarditída predstavovali časť poškodenia srdca počas infekcie SARS-CoV-2. Vplyv pandémie COVID-19 na výskyt tohto akútneho zápalového ochorenia srdca nebol systematicky hodnotený.

Cieľ: Preskúmať výskyt a prevalenciu zápalových ochorení srdca pred pandémiou COVID-19 a počas nej.

Metódy: Porovnali sme incidenciu a prevalenciu akútnych zápalových ochorení srdca (myokarditída, perikarditída) v provinciách Pisa, Lucca a Livorno v dvoch časových intervaloch: pred (PRECOVID, od 1. júna 2018 do 31. mája 2019) a počas pandémie COVID-19 (COVID, od 1. júna 2020 do mája 2021).

Výsledky: Celkovo sa v záujmových oblastiach vyskytlo 259 prípadov zápalového ochorenia srdca (myokarditída a/alebo perikarditída). Ročná incidencia bola 11,3 prípadov na 100,000 obyvateľov. Konkrétne 138 prípadov sa vyskytlo v období pred COVIDom a 121 prípadov v období COVIDu. Ročný výskyt zápalových ochorení srdca sa významne nelíšil (12,1/100,000 v PRECOVID oproti 10,3/100,000 v COVID, P = 0,22). Ročný výskyt myokarditídy bol významne vyšší v PRECOVID ako v COVID, resp. 8,1/100,000/rok oproti 5,9/100,000/rok (P = 0,047), čo predstavuje čisté zníženie počtu prípadov o 27%. Najmä výskyt myokarditídy bol signifikantne nižší v COVID ako v PRECOVID vo vekovej triede 18–24 rokov. Napriek tomu mala myokarditída z obdobia COVID viac abnormalít pohybu steny a väčší rozsah LGE. Ročný výskyt perikarditídy sa naopak významne nelíšil (4,03/100 000 vs, 4,47/100 000, P = 0,61).

Záver: Napriek možnej etiologickej úlohe SARS-CoV-2 a očakávanému zvýšenému výskytu myokarditídy a perikarditídy údaje tejto predbežnej štúdie s geograficky obmedzenou vzorkou naznačujú pokles akútnej myokarditídy a stabilný výskyt perikarditídy a myoperikarditídy/perimyokarditídy.

Aquaro et al.

Metaanalýza to potvrdzuje.

Tento rozdiel v kardiálnom riziku medzi vakcínou a vírusom by nemal byť prekvapením. Intramuskulárne (IM) podanie prichádza s okamžitým potenciálnym prístupom do cievneho systému. V štúdiách hodnotiacich kvalifikované zdravotné sestry, ktoré používajú aspiračné techniky, sa uvádza 1,9% miera zasiahnutia žily alebo tepny. Náhodná intravenózna injekcia v zubnom lekárstve je ešte vyššia, a to 4 % pri aspiračnej aplikácii. Vakcíny SARs-CoV-2 si dokonca nevyžadujú aspiráciu a pravdepodobne majú vyššiu mieru náhodného intravenózneho podania. Marc Girardot sa touto problematikou podrobne zaoberal. –> (slov. prekl.)

Na opačnej strane tejto rovnice rizika zisťujeme, že infekcia z C19 preukázateľne poskytuje trvalejšiu imunitu ako vakcíny úzko zamerané na spike proteíny. Prirodzená imunita poskytuje slizničné protilátky a rozpoznanie T-buniek proteómu odvodeného z celého 30kb vírusového genómu, kde sa vakcíny zameriavajú na malú ~4kb (1273 aminokyselín) oblasť vírusu.

Táto stratégia vakcín s úzkym epitopom má v súčasnosti zdokumentované únikové mutácie, kde väčšina mutácií od delta po omikrón sú varianty meniace aminokyseliny v doméne hrotu, na ktorú sa zameriava vakcinačný program. Toto obohatenie o varianty meniace aminokyseliny oproti synonymným variantom je znakom selekcie. Vakcíny, ktoré nezastavia prenos a nedokážu obmedziť vírusovú záťaž pacienta, ponechávajú evolučné hodiny vírusu (RdRp polymerázu) nedotknuté, ale len riadia evolúciu okolo pádla, ktoré ste umiestnili do rieky. Chau a kol. preukázali vyššiu vírusovú záťaž u očkovaných. Štúdia prechádzala viacerými variantmi, ale iné štúdie naznačujú rovnakú až mierne nižšiu vírusovú záťaž u očkovaných. Dokonca aj v týchto prípadoch je odchýlka niekoľko KT a v rozsahu 10^8. Dahdouh et al. preukázali až 10 CT odchýlky len pri výteroch, čo naznačuje mnoho zmätočných faktorov týchto štúdií. Malá zmena TK je v rozsahu 100 miliónov molekúl a je taká vysoká u očkovaných aj neočkovaných, že rozdiel 2 TK je irelevantný vzhľadom na rádovo nižšie požiadavky na minimálnu infekčnú dávku (10^6).

Zistenia

V období od 11. do 25. júna 2021 (7–8 týždňov po druhej dávke) bolo 69 zamestnancov pozitívne testovaných na SARS-CoV-2. Na štúdii sa zúčastnilo 62 osôb. Väčšina z nich bola asymptomatická alebo mierne symptomatická a všetci sa zotavili. Získalo sa 22 kompletných genómových sekvencií; všetky boli variant Delta a boli fylogeneticky odlišné od súčasných vírusov získaných z komunity alebo z nemocnice od pacientov prijatých pred vypuknutím epidémie. Vírusová záťaž odvodená z hodnôt Ct bola 251-krát vyššia ako v prípadoch infikovaných pôvodným kmeňom v marci/apríli 2020. Medián času od stanovenia diagnózy do negatívnej PCR bol 21 dní (rozpätie 8–33). Neutralizačné protilátky (vyjadrené ako percento inhibície) merané po druhej dávke vakcíny alebo pri stanovení diagnózy boli v prípadoch nižšie ako v neinfikovaných, plne zaočkovaných kontrolách (medián (IQR): 69,4 (50,7–89,1) oproti 91,3 (79,6–94,9), p=0,005 a 59,4 (32,5–73,1) oproti 91,1 (77,3–94,2), p=0,002). Nebola zistená žiadna korelácia medzi vakcínou- indukovanými hladinami neutralizačných protilátok a maximálnou vírusovou záťažou alebo rozvojom symptómov.

Chau a kol. "Vietnamská štúdia"

Je dobre známe, že tieto vakcíny nezastavujú prenos a nedávne štúdie z Clevelandskej kliniky (predtlač) –> (slov. prekl.) dokonca dokazujú negatívnu účinnosť vakcíny s každou ďalšou vakcínou. Dokazujú tiež účinok závislý od dávky alebo "biologický gradient", čo je jeden z princípov Bradford Hillových podmienok kauzality. To znamená, že vakcíny oslabujú imunitný systém pacientov a robia ich náchylnejšími na C19 a iné infekcie.

Zdá sa teda, že politika očkovania na univerzitách porušuje základnú lekársku etiku, pretože žiada študentov, aby prijali negatívny pomer rizika a prínosu lekárskeho zásahu s cieľom chrániť staršiu fakultu. Využívajú tak svoje študentské telá ako ľudské štíty, pričom neinformujú o tom, že štít má pre svojho používateľa cenu "ruskej rulety". Ide o nesprávne informovaný nátlak, nie o informovaný súhlas.

Týka sa to najmä vakcín, ktoré nezastavujú prenos a vo viacerých štúdiách vykazujú známky negatívnej účinnosti (Barnstable Mass). Štúdia Barnstable Mass vedená CDC ukázala vyššiu mieru infekcie medzi očkovanými. V Austrálii je v súčasnosti 96% zaočkovaných (vo veku 16+ 2 dávkami) a nemocnice sú obohatené o viac ako 96% zaočkovaných pacientov. Nadmerná úmrtnosť v Austrálii je po očkovaní vyššia ako počas pandémie pred očkovaním.

Bivalentné posilňovacie vakcíny neboli v tejto vekovej skupine študentov nikdy dostatočne preskúmané. Paul Offit sa nechal počuť, že v súvislosti so schválením týchto vakcín povedal "The fix was in" (Oprava vykonaná). Namiesto rozsiahlych RCT sa pri schvaľovaní bivalentných posilňovacích vakcín používali prevažne údaje z myší. Dokonca aj RCT, ktoré boli vykonané na vakcínach BNT162b2 a mRNA1273, boli opätovne analyzované nezávislými výskumníkmi (Fraiman a kol.) a zistilo sa, že nemajú žiadny prínos (Bardosh a kol.).

Byram Bridle vysvetľuje, ako bolo selektívne uvedenie skóre zníženia relatívneho rizika spoločnosti Pfizer na trh porušením politiky FDA. Napriek tomu sa stretlo s búrlivým potleskom.

Pôvodné vakcíny, ktoré boli zamerané na proteín hrotu Wuhan-1, nikdy neposkytli kontrolu kvality sekvenovania DNA od šarže k šarži. Nikdy neposkytli žiadne dôkazy o transkripčnej alebo translačnej vernosti týchto prostriedkov. To je mimoriadne dôležité, keďže vakcíny obsahovali nukleotid náchylný na chyby, známy ako N1-metyl-pseudouridín (m1Ψ), o ktorom je známe, že zvyšuje chybovosť transkripcie na 250–300/milión alebo 1 chybu na každých 4,000 nukleotidov (Chen et al.). To znamená chybu v každej syntetizovanej molekule vakcíny a 14–34 biliónov sa v prípade Pfizer, resp. Moderna. Ak sa testy jednotlivých molekúl (sekvenovanie Pacific Biosciences) použité na odhad tejto chybovosti prejavia v skutočných štúdiách na ľuďoch, ide o mimoriadny stupeň zložitosti.

Aby to bolo ešte horšie, vplyv tejto bázy na vernosť ribozómov nie je známy, ale publikované pokusy o modelovanie vplyvu pseudouridínov (nie N1-metyl-pseudoU alebo m1Ψ) na vernosť ukázali podstatné zvýšenie posunu ribozómového rámca, abláciu stop kodónu a translačnú chybu (Fernandez et al.). O štúdii, ktorá sa to pokúsila neúspešne spochybniť, sa hovorí tu.

Laboratórium Andrewa Firea sekvenovalo skoršie vakcíny, ale nikdy nezverejnilo surové sekvenčné čítania. Tieto údaje sú potrebné na riešenie obáv týkajúcich sa miery transkripčných chýb a heteroplaziem.

Pre nové bivalentné vakcíny, ktoré sa podávajú deťom, neexistujú žiadne verejné sekvenčné údaje. Podľa údajov CDC bolo v čase písania tohto článku podaných viac ako 50 miliónov bivalentných vakcín.

Spoločnosť Pfizer predpovedá vysoký predaj na 3 roky.

KBirb @birb_k

Pfizer forecasting nearly 500 million mRNA COVID doses in 2023-2026, with years 2025 & 2026 being a combo COVID/Flu mRNA. Pfizer’s share, at recent rumored price of $120/dose is $37 billion just for the U.S. They foresee a huge CASH COW. Source: investors.pfizer.com/Investors/Even…

Spoločnosť Pfizer predpovedá takmer 500 miliónov mRNA dávok proti COVIDu v rokoch 2023–2026, pričom v rokoch 2025 a 2026 pôjde o kombinovanú mRNA proti COVIDu a chrípke. Podiel spoločnosti Pfizer pri nedávnej údajnej cene 120 USD za dávku predstavuje 37 miliárd USD len pre USA. Predpokladajú obrovský zisk.

Keďže verejné údaje o zabezpečovaní kvality a kontrole kvality týchto bivalentných vakcín sú obmedzené, snažili sme sa nezávisle monitorovať integritu RNA bivalentných vakcín spoločností Pfizer a Moderna. Vzorky z injekčných liekoviek boli prečistené a vyhodnotené pomocou elektroforézy. Vytvorili sa smerové knižnice RNA-seq a sekvenovali sa na sekvenátoroch Illumina.

Pre bivalentnú vakcínu Pfizer existujú dokumenty EMA z augusta 2022. V týchto dokumentoch sa uvádza, že údaje NGS (sekvenovanie novej generácie) existujú, ale neboli dodané agentúre EMA. Agentúra EMA tiež zaznamenala, že na charakterizáciu preloženého produktu sú k dispozícii len Western Bloty a že pásy nezodpovedajú predpokladaným veľkostiam.

údaje o charakterizácii omikrónového variantu, ktoré sa považujú za povinné na zaručenie bezpečnosti výrobku.

V odpovedi Žiadateľ poskytol údaje o charakteristike variantu Omicron (BA.1). Balík obsahuje potvrdenie primárnej štruktúry, 5'-Cap štruktúry, štruktúry vyššieho rádu a biologickej aktivity. V podstate sa použili rovnaké metódy ako pri charakterizácii pôvodného variantu s tým, že analýza primárnej štruktúry pomocou NGS bola vylúčená. Štúdie HPLC-UV a LC-MS/MS sa však považujú za dostatočné na potvrdenie primárnej štruktúry

Biologická aktivita sa potvrdila analýzou Western blot a in vitro transláciou bez buniek. To sa považuje za prijateľné. Chýbajú však niektoré podrobnosti pre Western blot analýzu a identita pozorovaných pásov nie je jasná. Odporúča sa, aby žiadateľ poskytol tieto informácie po schválení.

Veľkosť exprimovaného proteínu pre BNT162b2 Omicron (B.1.1.529) DS sa hodnotí pomocou western blotu. Žiadateľ tvrdí, že veľkosť proteínu zodpovedá očakávanej veľkosti preloženého proteínu. Teoretické veľkosti zrelého proteínu a jeho variantov však v dokumentácii nie sú uvedené. Tieto informácie by sa mali uviesť a mali by sa priradiť pásy pozorované pomocou WB. Okrem toho by sa mala bližšie opísať protilátka použitá na western blot...

Titulok od EMA

Metódy

Obrázky a čísla šarží injekčných liekoviek s vakcínou. Injekčné liekovky spoločnosti Pfizer pochádzajú z rovnakej šarže. Šarže spoločnosti Moderna sa líšia.

Čísla šarží vakcín a QR kódy

Metódy

Čistenie mRNA z LNP.

Z každej injekčnej liekovky sa odobralo 100ul vzorky (1/3 až 1/5 dávky)

Do 100ul vakcíny sa pridalo 5ul 2% LiDs na rozpustenie LNPs
100ul 100% izopropanolu
233ul Ampure (Beckman Genomics)
25ul 25mM MgCl2 (New England Biolabs)

Vzorky sa 10x premiešali špičkou a inkubovali sa 5 minút na naviazanie magnetických guličiek.

Magnetické guľôčky boli oddelené na 96-jamkovej magnetickej platni počas 10 minút a dvakrát premyté 200ul 80% EtOH.

Korálky sa nechali 3 minúty vyschnúť na vzduchu a eluovali sa v 100ul ddH20. Na páskovej stanici Agilent sa spustili 2ul eluovanej vzorky.

Konštrukcia knižnice

50ul z každej 100ul vzorky sa premenilo na knižnice RNA-Seq pre sekvenovanie Illumina pomocou súpravy NEB NEBNext UltraII Directional RNA library Kit for Illumina (NEB#E7760S).

Na obohatenie knižníc s dlhšími vložkami sa čas fragmentácie skrátil z 15 minút na 10 minút a čas syntézy prvého vlákna sa predĺžil pri 42°C na 50 minút podľa odporúčaní pre dlhé vložky v protokole.

Nevykonala sa deplécia Ribo ani obohatenie PolyA, aby sa zabezpečilo čo najobjektívnejšie hodnotenie všetkých fragmentov v knižnici. Knižnica sa amplifikovala 16 cyklov podľa protokolu výrobcu. Na vyhodnotenie jednovláknovej povahy mRNA sa použila metóda smerovej konštrukcie knižnice. Ide o dôležitú metriku kvality v dokumentoch EMA a TGA o zverejňovaní informácií, keďže dsRNA (> 0,5%) môže vyvolať vrodenú imunitnú reakciu. Obsah dsRNA sa často odhaduje pomocou testu ELISA. Smerové sekvenovanie DNA ponúka komplexnejšiu metódu na jej odhad a predtým bola nameraná a 99,99% v Jeong et al. Nie je jasné, ako sa môže líšiť v jednotlivých šaržiach alebo v rámci nového výrobného procesu pre novšie bivalentné vakcíny.

Výsledky

Analýza fragmentov každej injekčnej liekovky je znázornená na obrázku 1. Fragmentácia RNA je zjavná v oboch značkách a vo všetkých šaržiach, ale je obzvlášť výrazná v injekčných liekovkách spoločnosti Pfizer. Prekvapivo sa v bivalentných vakcínach pozorovali aj produkty mRNA dlhšie, ako je predpokladaná dĺžka mRNA.

Obr. 1. Elektroforéza bivalentných vakcín na páskovej stanici Agilent. Moderna mRNA-1273.214 (hore) a bivalentná vakcína Pfizer (dole)

Tieto dlhšie fragmenty sú zaznamenané v práci Patel et al. pri monovalentných vakcínach.

Prvým krokom pri vytváraní knižníc RNA-Seq je fragmentácia týchto mRNA a ich premena na DNA.

Fragmentácia RNA (v závislosti od vzorky)

Syntéza prvého vlákna cDNA

Syntéza druhého vlákna cDNA

Oprava koncov/dA-koncovka

Adaptérová ligácia

USER-enzýmové trávenie

PCR obohacovanie knižníc

Tu je opísaná "smerová" metóda konštrukcie knižnice. Smerové knižnice zabezpečujú zachytenie poznatkov o vlákne (watsonovo vs. crickovo vlákno) a v dôsledku toho možno lepšie odhadnúť kontamináciu dvojvláknovou DNA alebo RNA pri syntéze mRNA vakcíny.

Krok syntézy 1. vlákna môže vniesť ďalšiu chybu na základe citlivosti reverznej transkriptázy na m1Ψ. Syntéza sa začína reverznou transkriptázou (RT polymerázou) a náhodnými primermi (5'NNNNNN-3'OH). Keď sa tieto náhodné primery hybridizujú s RNA, enzým RT začlení nukleotid, ktorý najlepšie zodpovedá templátu. Tieto templáty majú bázu, o ktorej je známe, že narúša vernosť párovania báz (m1Ψ).

Po syntéze prvého vlákna dochádza k efemérnej syntéze druhého vlákna DNA, ktoré obsahuje enzýmovo "vymazateľnú" bázu (Uracil na báze DNA). To uľahčuje ligáciu dvojvláknových sekvenačných adaptérov na molekuly dsDNA. Po ligácii adaptorov sa toto druhé vlákno vymaže pomocou enzýmu UDG/UNG alebo enzýmu USER od spoločnosti New England BioLabs.

Treba poznamenať, že tento enzým USER štiepi uracily na báze DNA, nie uracily na báze RNA. V dôsledku toho sa ako templát pre PCR knižnice používa len syntéza prvého vlákna. Keďže chyby polymerázy na báze PCR sú rádovo menej časté (1:100,000) ako chyby reverznej transkriptázy (1:10,000), mali by sme vidieť chyby prevažne zo syntézy 1. vlákna pri pokuse o replikáciu m1Ψ RNA templátu. Konečný výsledok tohto prístupu bude mať predovšetkým 2 spôsoby chýb.

Polymeráza T7 RNA sa používa na syntézu vakcín mRNA z expresného vektora na báze DNA. Polymeráza T7 RNA bude mať zvýšenú chybu inkorporácie s m1Ψ.
Chyba reverznej transkripcie z premeny vakcíny m1Ψ modifikovanej mRNA na DNA pre sekvenovanie Illumina.

Na obrázku 2 sú znázornené konečné veľkosti knižníc vytvorených týmito metódami. Tieto neodrážajú výrobný proces žiadneho z poskytovateľov vakcín, ale predstavujú očakávané výsledky zo súpravy založenej na RNA-Seq.

Obr. 2. Knižnice Illumina po 16 cykloch PCR. Knižnice možno pravdepodobne získať aj s 12 cyklami PCR, pretože bimodálne rozloženie amplikonov je znakom príliš veľkého množstva vstupnej DNA do knižnice PCR. Zhlukovanie Illumina bude uprednostňovať kratšie amplikony, ale pri bimodálnej amplifikácii môže vzniknúť vyšší počet nesprávne spárovaných čítaní.

4 knižnice prekryté na porovnanie

Analytická pipeline

Čítania boli demultiplexované a spracované pomocou

Trimgalore – odstraňuje adaptéry sekvenovania Illumina
Megahit – zostaví čítania do kontigov
Megahit pre SARs-CoV-2
Samtools – generuje súbory BAM na zobrazenie v IGV
BWA-mem – mapovač krátkych čítaní, ktorý sa používa na zarovnanie čítaní späť k zostaveným referenciám
Softvér SnapGene – (www.snapgene.com) – používa sa na vizualizáciu a anotáciu expresných vektorov
IGV – Integrated Genome Viewer (integrovaný prehliadač genómu), ktorý sa používa na vizualizáciu čítaní sekvenovania Illumina

Výsledky sekvenovania

Keďže tieto ciele mRNA sú také malé (4Kb), môžu byť označené čiarovým kódom DNA a ľahko sa zmestia do akéhokoľvek priebehu sekvenovania. Dráhy Illumina HiSeq 4000 zvyčajne produkujú viac ako 300 miliónov 150bp čítaní na dráhu. 0,5% týchto čítaní (1,5 milióna čítaní) vytvára ~225 Mb sekvencie v rámci 4Kb fragmentu. 50,000-násobné pokrytie v rámci 4Kb fragmentu je chybová hranica súčasného výstupu sekvenátora, čo zdôrazňuje cenovú dostupnosť sekvenovania každej dávky. Cenníková cena za 300M čítaní v mnohých sekvenačných servisných centrách je ~1300 USD. Náklady na sekvenovanie týchto vzoriek boli 7 USD za injekčnú liekovku a použila sa iba 1/3 dávky (100ul). Náklady na konštrukciu knižnice mohli pridať ďalších 50 USD nákladov.

V bivalentných vakcínach Moderna sa nachádzajú dva rôzne expresné vektory. Sekvenovali sa dve rôzne dávky a v každej dávke môžu byť rôzne expresné plazmidy v pozadí. Všimnite si, že keďže tieto vakcíny majú bivalentné inzerty, zostavovateľ často rozdeľuje inzerty do samostatných kontigov (omicron vs wuhan-1). Pripojil som celý výstupný súbor z megahitu, aby si verejnosť mohla dovoliť ďalšie leštenie týchto odkazov. Tieto návrhy zostáv boli ponechané v surovej forme dodanej priamo z megahitu, aby si mohli dovoliť reprodukciu práce.

Obr. 3. Moderna bivalentná fľaštička č. 2. Môže ísť o prázdny vektor alebo o artefakt zostavy, ktorý sa môže vyskytnúť, keď je pokrytie inzertu 1000x vyššie ako pokrytie vektora

>k141_45 flag=1 multi=60.0000 len=2943 CTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAACCTGAGGCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGGTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGCCCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAACACCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCTAGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGTTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCTCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGTTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCTTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCGATCTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAGCCATGGGGCGGAGAATGGGCGGAACTGGGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGACTATGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCTAACTGACACACATTCCACAGCTGGTTCTTTCCGCCTCAGGATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTACGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCATGAACAGACTGTGAGGACTGAGGGGCCTGAAATGAGCCTTGGGACTGTGAATCTAAAATACACAAACAATTAGAATCAGTAGTTTAACACATTATACACTTAAAAATTGGATCTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATGTTAAACGGCGGAGCTACCACACCGGTTGGAGCTCTTCTTTTTTT

Obr. 4. Vektor Moderna s vloženým hrotom z tej istej injekčnej liekovky č. 2 ako na obrázku 3

>k141_73 flag=1 multi=13386.0482 len=6777 CTGCAGGCTCTGCAGCCGGCCAGTGATCAGCCGGTCGATCTGCACCTCGGCCTCGGGAGGGTCCAGCCGGCTCAGGATGTCGTTCAGCACGCTGCTGATGGCGCCGAACTTGCTGCTCAGCTGCTTCACCAGGGTGTTCAGGGCCTGGGCGTTCTGGTTCACCACGTCCTGCAGCTTGCCCAGGGCGCTAGCGGTGCTGCTCAGGCTGTCCTGGATCTTGCCGATGGCGCTGTTGAACTGGTTGGCGATCAGCTTCTGGTTCTCGTACAGAACGTTCTGGGTCACGCTGATGCCGTTGAACCGGTAGTCGATCTGCATGGCGAAGGTGATCTGCAGAGCGGCTCCAGCGCCGAAAGTCCAGCCGCTGGTGATGGTTCCGGCGAACAGGGCGCTGGTGTACTGGCGATCATCTCGTCGGTCAGCAGGGGAGGCAGCACGGTCAGGCCGTTGAACTTCTGGGCGCAGATCAGGTCCCGGGCGGCTATGTCGCCGAGGCAGTCGCCGTAGCTTGATGAAGCCGGCGTCGGCTAGGGTCACCTTGTTGAACAGCAGGTCCTCGATGAAGCTCCGCTTGCTGGGCTTGCTGGGGTCGGGCAGGATCTGGCTGAAGTTGAAGCCGCCGAAGTCCTTGATGGGAGGGGTCTGGAACTAGCAGAGGTGGTGAGTGGGGCAGGTGGAGGTGGGAGCATACCTGGGACCCGAGGTCGGGGGAGACTCGGGGTACCCAGGACGGGAAAGGGGCAGCTAGCATTGCGTGCATGCAGTACCAGCTCGAGTCATCATGTGTAGTGCAGTTTCACGCCCTTCAGCACGGGCTCAGAATCGTCCTCGTCGAACTTGCAGCAGCTGCCACAGCTACAACAGCCCTTCAGGCAGCTACAGCAGCTGGTCATGCAACACAGCATGATTGTGACCATCACGATGGCAATCAGTCCGGCGATAAAGCCCAGCCAGATGTACCAGGGCCACTTGATGTACTGCTCGTACTTCCCCAGTTCTTGCAGGTCGATCAGGCTCTCGTTCAGATTCTTGGCCACCTCGTTCAGCCGATCGATCTCCTTCTGGATGTTCACCACGCTGGCGTTGATGCCGCTGATGTCGCCCAGGTCCACGTCGGGGCTGGTGTGATTCTTGAAGTACTTGTCCAGCTCCTCCTTGAAGCTGTCCAGCTCGGGCTGCAGGGGATCGTACACGGTGTTGTTCACGATGCCGATCACCACGTCGCAGTTGCCGCTCACGAAGGTGTTGTCGGTGGTGATGATCTGGGGCTCGTAGAAGTTCCGCTGGGTCACGAACCAGTGGGTGCCGTTGCTCACGAACACGCCCTCCCGGGGAAAGTGGGCCTTGCCGTCGTGGCAGATGGCTGGGGCGGTGGTGAAGTTCTTCTCCTGGGCGGGCACGTAGGTCACGTGCAGGAACACCACTCCGTGGGGTGCGCTCTGGGGAAAGCTCATCAGGTGGTAGCCCTTGCCGCAGAAGTCCACCCGCTTGCTCTGGCCCAGCACGCACTCGCTCATCTTGGTGGCGGCCAGGTTGGCGCTGGCCCGAATCTCGGCGGCCCGGATCAGCTGCTGGGTCACGTAGGTCTGCAGGCTCTGCAGCCGGCCAGTGATCAGCCGGTCGATCTGCACCTCGGCCTCGGGAGGGTCCAGCCGGCTCAGGATGTCGTTCAGCACGCTGCTGATGGCGCCGAAGTTGCTGCTCAGCTGCTTCACCAGGGTGTTCAGGGCCTGGGCGTTGTGGTTCACCACGTCCTGCAGCTTGCCCAGGGCGCTAGCGGTGCTGCTCAGGCTGTCCTGGATCTTGCCGATGGCGCTGTTGAACTGGTTGGCGATCAGCTTCTGGTTCTCGTACAGCACGTTCTGGGTCACGCCGATGCCGTTGAACCGGTAGGCCATCTGCATGGCGAAGGGGATCTGCAGAGCGGCTCCAGCGCCGAAAGTCCAGCCGCTGGTGATGGTTCCGGCTAACAGGGCGCTGGTGTACTGGGCGATCATCTCGTCGGTCAGCAGGGGAGGCAGCACGGTCAGGCCGTTGAACTTCTGGGCGCAGATCAGGTCCCGGGCGGCTATGTCGCCGAGGCAGTCGCCGTACTGCTTGATGAAGCCGGCGTCGGCTAGGGTCACCTTGTTGAACAGCAGGTCCTCGATGAAGCTCCGCTTGCTGGGCTTGCTGGGGTCGGGCAGGATCTGGCTGAAGTTGAAGCCGCCGAAGTACTTGATGGGAGGGGTCTTGTAGATCTGCTTCACCTGGGCGAACACCTGCTGGGTGTTCTTGTCCTGCTCCACGGCGATGCCGGTCAGGGCCCGGTTCAGCTGGGTGCAGAAGCTGCCGTACTGCAGCAGCAGGTTGCTGCACTCGGTGCTGTCGCCGCAGATGTACATGGTGCAGTCCACGCTGGTCTTGGTCATGCTCACGGGCAGAATCTCGGTGGTCACGCTGATGGTGAAGTTGGTGGGGATGGCGATGCTGTTGTTGCTGTAGGCCACGCTGTTCTCGGCGCCCAGGCTCATGGTGTAGGCGATGATGCTCTGGCTGGCCACGCTCCTTGCCCTCCGGTGTGACTTGGTCTGGGTCTGGTAGCTGGCACAGATGCCGGCGCCGATGGGGATGTCGCACTCGTAGCTGTTGTTCACGTGCTCGGCGCCGATCAGGCAACCGGCCCGGGTCTGGAACACGTTGCTGCCGGTGCTGTAGACCCGCCAGGTGGGTGTCAGCTGGTCGGCGTGGATGGCCACGGGCACCTCGGTGCAGTTCACACCCTGGTACAGCACGGCCACCTGGTTGCTGGTGTTGGTGCCTGGGGTGATCACGCTCACGCCGCCGAAGCTGCAAGGGGTGATGTCCAGGATCTCCAGGGTCTGGGGATCCCGCACAGCGTCGGTGGTGTCGGCGATGTCCCGGCCGAACTGCTGAAAGGGCAGGAATTTCTTGTTGCTCTCGGTCAGCACGCCGGTGCCGGTAAGGCCGTTGAAGTTGAAGTTCACGCACTTGTTCTTCACCAGGTTGGTGCTCTTCTTGGGGCCACACACGGTGGCTGGGGCGTGCAGCAGCTCGAAGCTCAGCACCACCACCCGGTAGGGCTGGTGGCCCACGCCGTAGGTGGGCCGGAAGCCGTAGCTCTGCAGAGGGAAGTAGCAGTTCACGCCGGCCACGCCGTTGCAAGGCTTGTTGCCGGCTTGGTAGATCTCGGTGCTGATGTCCCGCTCGAAGGGCTTCAGGTTGCTCTTCCGGAACAGCCGGTACCGGTAGTTGTAGTTGCCGCCCACCTTGCTGTCGAGCTTGTTGCTGTTCCAGGCGATCACGCAGCCGGTGAAGTCGTCGGGCAGCTTGTAGTTGTAGTCGGCGATGTTGCCTGTCTGGCCGGGTGCGATCTGGCTCACCTCGTTGCCACGGATCACGAAGCTGTCGGCGTACACGTTGGTGAAGCACAGGTCGTTCAGCTTGGTGGGGCTCACGCCGTAGCACTTGAAGGCGAAGAATGGGGCGAAGTTGTACAGCACGCTGTAGTCGGCCACGCAGTTGCTGATCCGCTTCCGGTTCCAGGCGTACACGCTGGCGAACCGGGTGGCGTTGAACACCTCGTCGAAGGGGCACAGGTTGGTGATGTTGGGGAACCGCACGATGCTCTCGGTGGGCTGCACCCGGAAGTTGCTGGTCTGGTAGATGCCCTTCTCCACGGTGAAGCTCTTCAGGGTGCACTTGGTCTCGCTCAGAGGGTCCAGGGCGCAGTCCACGGCGTCGGTGATGGTGCCGTTCTCGTTGTACTTCAGCAGGAAGGTCCGGGGCTGCAGGTAGCCCACGTAGTAAGCAGCCGCGCCTGCTGTCCACCCGCTGCTGCTGTCGCCTGGGGTCAGGTAGCTCCGGTGCAGGGCCAGCAGGGTCTGGAACCGGGTGATGTTGATGCCGATGGGCAGGTCCACCAGGGGCTCCAGGGCTGAGAAGCCCTGGGGCAGATCCCGCACCAGGTTGATTGGGGTGTGCTTGCTGTAGATCTTGAAGTAGCCGTCGATGTTCTTGAACACGAACTCCCGCAGGTTCTTGAAGTTGCCCTGCTTGCCCTCCAGGTCCATCAGGAAGGGCTGGCTCACGTACTCGAAGGTGCAGTTGTTGGCGCTGCTGTACACCCGGAACTCGCTCTCCATCCAGCTCTTGTTGTTCTTGTGGTAGTACACGCCCAGGAAGGGGTCGTTGCAGAACTGGAACTCGCACACCTTGATCACCACGTTGGTGGCGTTATTCACGATCAGCAGGCTCTGGGTCTTGCTGTCCAGGGTGGTGCCGAAGATCCAGCCCCGGATGATGTTGCTCTTCTCGGTGCTGGCGAAGTACACGCCGTCGTTGAAGGGCAGCACGGGGTTGTCGAACCGCTTGGTGCCGTTGGTGCCGCTGATGGCGTGGAACCAGGTCACGTTGCTGAAGAAGGGCAGGAACAGGTCCTGGGTGCTGTGCAGGACGCTGCTCCGGAACACCTTGTCGGGGTAGTAGACGCCCCGGGTGAAGCTGTTGGTGTAGGCTGGTGGCAGCTGGGTCCGGGTGGTCAGGTTCACGCACTGGCTGCTCACCAGGGGCAGCAGCACCAGGAACACGAACATGGTGGCGGCGCCGGGGTCTTATATTTCTTCTTACTCTTCTTTTCTCTCTTATTTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGCTTCTGTACGAGGGTCCAAAAGCTTGAGCCGGATCGAATTCGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGGAAAAGGGGCCCGAGCTTAAGACTGGCCGTCGTTTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATGCGTCAGGGGCCTTCTGCTTAGTTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGCTTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGAATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCTTGTGCAAGACGGAAGACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAGTGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAACGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGTGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCGTCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGCAGTGCGACTAACGGCATGAAGCTCGTCGGGGCTGGGTACCGAGCTCGCAAAAA

Obr. 5. Vektor bivalentnej vakcíny Moderna z injekčnej liekovky 1

>k141_175 flag=0 multi=24996.5933 len=3839 AAAAAATATAGACATCCCTTCAGAGTCCCGGGTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCGAGCTCGGTACCCAGCCCCGACGAGCTTCATGCCGTTAGTCGCACTGCAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTTCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAATATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGACGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCACTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCGTTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCACTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTCTTCCGTCTTGCACAAGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATTCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGCAAGCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTACGCGCGCGTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGCCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAACTAAGCAGAAGGCCCCTGACGCATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTCTGTGTTGTAAAACGACGGCCAGTCTTAAGCTCGGGCCCCTTTTCCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGAATTCGATCCGGCTCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACCATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGATCACCCGGACCCAGAGCTACACCAACAGCTTCACCCGGGGCGTCTACTACCCCGACAAGGTGTTCCGGAGCAGCGTCCTGCACAGCACCCAGGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCAGCGGCACCAACGGCACCAAGCGGTTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGCGTGTACTTCGCCAGCACCGAGAAGAGCAACATCATCCGGGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTGAATAACGCCACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGCGTGTACTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGCGAGTTCCGGGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGAGCCAGCCCTTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGCGGGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCAATCAACCTGGTGCGGGATCTGCCCCAGGGCTTCTCAGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTCCAGACCCTGCTGGCCCTGCACCGGAGCTACCTGACCCCAGGCGACAGCAGCAGCGGGTGGACAGCAGGCGCGGCTGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCCCGGACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGACTGCGCCCTGGACCCTCTGAGCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGCGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCCGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGTGGCAACGAGGTGAGCCAGATCGCACCCGGCCAGACAGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAAGCTCGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACATCTACCGGTACCGGCTGTTCCGGAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCAGCACCGAGATCTACCAAGCCGGCAACAAGCCTTGCAACGGCGTGGCCGGCGTGAACTGCTACTTCCCTCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACCGGGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCAGCCACCGTGTGTGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCTG

Expresný vektor v bivalentnej vakcíne Pfizer

Obr. 6. Vektor bivalentnej vakcíny Pfizer s anotáciou SEB/FCS

>k141_58 flag=1 multi=11090.9518 len=7479 GAGGTGGTGAGTGGGGCAGGTGGAGGTGGGAGCATACCTGGGACCCGAGGTCGGGGGAGACTCGGGGTACCCAGGACGGGAAAGGGGCAGCTAGCATTGCGTGCATGCAGTACCAGCTCGAGTCATCATGTGTAGTGCAGCTTCACGCCCTTCAGCACGGGCTCGCTGTCGTCCTCGTCGAACTTGCAGCAGCTGCCGCAGCTGCAACAGCCCTTCAGGCAGCTGCAGCAGCTGGTCATGCAGCACAGCATGATGGTCACCATCACGATGGCGATCAGGCCGGCGATGAAGCCCAGCCAGATGTACCAGGGCCACTTGATGTACTGCTCGTACTTGCCCAGCTCCTGCAGGTCGATCAGGCTCTCGTTCAGGTTCTTGGCCACCTCGTTCAGCCGATCGATCTCCTTCTGGATGTTCACCACGCTGGCGTTGATGCCGCTGATGTCGCCCAGGTCCACGTCGGGGCTGGTGTGATTCTTGAAGTACTTGTCCAGCTCCTCCTTGAAGCTGTCCAGCTCGGGCTGCAGGGGATCGTACACGGTGTTGTTCACGATGCCGATCACCACGTCGCAGTTGCCGCTCACGAAGGTGTTGTCGGTGGTGATGATCTGGGGCTCGTAGAAGTTCCGCTGGGTCACGAACCAGTGGGTGCCGTTGCTCACGAACACGCCCTCCCGGGGAAAGTGGGCCTTGCCGTCGTGGCAGATGGCTGGGGCGGTGGTGAAGTTCTTCTCCTGGGCGGGCACGTAGGTCACGTGCAGGAACACCACTCCGTGGGGTGCGCTCTGGGGAAAGCTCATCAGGTGGTAGCCCTTGCCGCAGAAGCCCACCCGCTTGCTCTGGCCCAGCACGCACTCGCTCATCTTGGTGGCGGCCAGGTTGGCGCTGGCCCGAATCTCGGCGGCCCGGATCAGCTGCTGGGTCACGTAGGTCTGCAGGCTCTGCAGCCGGCCAGTGATCAGCCGGTCGATCTGCACCTCGGCCTCGGGAGGGTCCAGCCGGCTCAGGATGTCGTTCAGCACGCTGCTGATGGCGCCGAACTTGCTGCTCAGCTGCTTCACCAGGGTGTTCAGGGCCTGGGCGTTGTGGTTCACCACGTCCTGCAGCTTGCCCAGGGCGCTAGCGGTGCTGCTCAGGCTGTCCTGGATCTTGCCGATGGCGCTGTTGAACTGGTTGGCGATCAGCTTCTGGTTCTCGTACAGCACGTTCTGGGTCACGCCGATGCCGTTGAACCGGTAGGCCATCTGCATGGCGAAGGGGATCTGCAGAGCGGCTCCAGCGCCGAAAGTCCAGCCGCTGGTGATGGTTCCGGCTAACAGGGCGCTGGTGTACTGGGCGATCATCTCGTCGGTCAGCAGGGGAGGCAGCACGGTCAGGCCGTTGAACTTCTGGGCGCAGATCAGGTCCCGGGCGGCTATGTCGCCGAGGCAGTCGCCGTACTGCTTGATGAAGCCGGCGTCGGCTAGGGTCACCTTGTTGAACAGCAGGTCCTCGATGAAGCTCCGCTTGCTGGGCTTGCTGGGGTCGGGCAGGATCTGGCTGAAGTTGAAGCCGCCGAAGTCCTTGATGGGAGGGGTCTTGTAGATCTGCTTCACCTGGGCGAACACCTCCTGGGTGTTCTTGTCCTGCTCCACGGCGATGCCGGTCAGGGCCCGGTTCAGCTGGGTGCAGAAGCTGCCGTACTGCAGCAGCAGGTTGCTGCACTCGGTGCTGTCGCCGCAGATGTACATGGTGCAGTCCACGCTGGTCTTGGTCATGCTCACGGGCAGAATCTCGGTGGTCACGCTGATGGTGAAGTTGGTGGGGATGGCGATGCTGTTGTTGCTGTAGGCCACGCTGTTCTCGGCGCCCAGGCTCATGGTGTAGGCGATGATGCTCTGGCTGGCCACGCTCCTTGCCCTCCGGGGTGAATTGGTCTGGGTCTGGTAGCTGGCACAGATGCCGGCGCCGATGGGGATGTCGCACTCGTAGCTGTTGTTCACGTGCTCGGCGCCGATCAGGCAACCGGCCCGGGTCTGGAACACGTTGCTGCCGGTGCTGTAGACCCGCCAGGTGGGTGTCAGCTGGTCGGCGTGGATGGCCACGGGCACCTCGGTGCAGTTCACACCCTGGTACAGCACGGCCACCTGGTTGCTGGTGTTGGTGCCTGGGGTGATCACGCTCACGCCGCCGAAGCTGCAAGGGGTGATGTCCAGGATCTCCAGGGTCTGGGGATCCCGCACAGCGTCGGTGGTGTCGGCGATGTCCCGGCCGAACTGCTGAAAGGGCAGGAATTTCTTGTTGCTCTCGGTCAGCACGCCGGTGCCGGTAAGGCCGTTGAAGTTGAAGTTCACGCACTTGTTCTTCACCAGGTTGGTGCTCTTCTTGGGGCCACACACGGTGGCTGGGGCGTGCAGCAGCTCGAAGCTCAGCACCACCACCCGGTAGGGCTGGTGGCCCACGCCGTAGGTGGGCCGGAAGCCGTAGCTCTGCAGAGGGAAGTAGCAGTTCACGCCGGCCACGCCGTTGCAAGGCTTGTTGCCGGCTTGGTAGATCTCGGTGCTGATGTCCCGCTCGAAGGGCTTCAGGTTGCTCTTCCGGAACAGCCGGTACCGGTAGTTGTAGTTGCCGCCCACCTTGCTGTCGAGCTTGTTGCTGTTCCAGGCGATCACGCAGCCGGTGAAGTCGTCGGGCAGCTTGTAGTTGTAGTCGGCGATGTTGCCTGTCTGGCCGGGTGCGATCTGGCTCACCTCGTTGCCACGGATCACGAAGCTGTCGGCGTACACGTTGGTGAAGCACAGGTCGTTCAGCTTGGTGGGGCTCACGCCGTAGCACTTGAAGGCGAAGAATGGGGCGAAGTTGTACAGCACGCTGTAGTCGGCCACGCAGTTGCTGATCCGCTTCCGGTTCCAGGCGTACACGCTGGCGAACCGGGTGGCGTTGAACACCTCGTCGAAGGGGCACAGGTTGGTGATATTGGGGAACCGCACGATGGATTCGGTGGGCTGCACCCGGAAGTTGCTGGTCTGGTAGATGCCCTTTTCCACGGTGAAGGACTTCAGGGTGCACTTTGTCTCGCTCAGAGGATCCAGAGCACAATCCACGGCGTCGGTGATGGTGCCGTTCTCGTTGTACTTCAGCAGGAAGGTTCTAGGCTGCAGGTAGCCCACATAGTAAGCGGCGGCACCAGCTGTCCATCCGCTGCTGCTATCGCCAGGTGTCAGGTAGCTTCTGTGCAGGGCCAGCAGTGTCTGAAACCGGGTGATGTTGATGCCGATGGGCAGATCCACCAGGGGTTCCAGAGCAGAGAAGCCCTGAGGCAGATCCCGCACGAGGTTGATAGGGGTGTGCTTGCTGTAGATCTTGAAGTAGCCGTCGATGTTCTTAAACACGAACTCGCGCAGGTTCTTGAAGTTGCCCTGCTTGCCTTCCAGGTCCATCAGGAAAGGCTGGGACACGTACTCGAAGGTGCAGTTGTTGGCGCTGCTGTACACCCGGAACTCGCTTTCCATCCAGCTCTTGTTGTTCTTGTGGTAGTAGACGCCCAGGAAGGGGTCGTTGCAGAACTGGAACTCGCACACTTTGATGACCACGTTGGTGGCGTTGTTCACGATCAGCAGGCTCTGGGTCTTGCTGTCCAGTGTGGTGCCGAAGATCCAGCCTCTGATGATGTTGGACTTCTCGGTGCTGGCAAAGTACACCCCGTCGTTGAAGGGCAGCACGGGGTTGTCGAATCTCTTGGTGCCATTGGTGCCGGAGATGGCGTGGAACCAGGTCACGTTGCTGAAGAAAGGCAGGAACAGGTCCTGGGTAGAGTGCAGCACGCTGGATCTGAACACCTTGTCGGGGTAGTACACGCCTCTGGTAAAGCTGTTGGTGTAGGCTGGAGGCAGCTGTGTTCTGGTGGTCAGGTTCACACACTGGCTGGACACCAGAGGCAGCAGCACCAGGAACACGAACATGGTGGCGGGTTCTCTCTGAGTCTGTGGGGACCAGAAGAATACTAGTTTATTCTTATAGTGAGTCGTATTAATTAATAACTAATGCATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAACCTGAGGCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGGTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGCCCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAACACCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCTAGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGTTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCTCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGTTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCTTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCGATCTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAGCCATGGGGCGGAGAATGGGCGGAACTGGGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGACTATGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCTAACTGACACACATTCCACAGCTGGTTCTTTCCGCCTCAGGATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTACGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCATGAACAGACTGTGAGGACTGAGGGGCCTGAAATGAGCCTTGGGACTGTGAATCTAAAATACACAAACAATTAGAATCAGTAGTTTAACACATTATACACTTAAAAATTGGATCTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATGTTAAACGGCGGAGCTACCACACCGGTTGGAGCTCTTCTTTTTTTTTTTTTTTT

Obr. 7. Táto zostava rozdelila proteín hrotu pravdepodobne v dôsledku divergencie omikronu a Wuhan-1s. Výsledkom je 702 bp proteínu hrotu zdvojeného na koncoch molekuly v poludňajšom hash mark

>k141_4 flag=0 multi=20285.8167 len=8652 GGGCTTCTCTGCTCTGGAACCCCTGGTGGATCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCTGGCGATAGCAGCAGCGGAGGGACAGCTGGTGCCGCCGCTTACTATGTGGGCTAACTGCAGCCTAGAACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGACTGCGCCCTGGACCCTCTGAGCGAGACCACGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGCGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCCGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGTGGCGACGAGGTGCGGCAGATCGCACCCGGCCAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAACCTCGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCAGCACCGAGATCTACCAAGCCGGCTCCACCCCTTGCAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCTCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACCGGGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCAGCCACCGTGTGTGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTTACCGGCACCGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAATTCCTGCCCTTTCAGCAGTTCGGCCGGGACATCGCCGACACCACCGACGCTGTGCGGGATCCCCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACCCCTTGCAGCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCAGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGGTGTGAACTGCACCGAGGTGCCCGTGGCCATCCACGCCGACCAGCTGACACCCACCTGGCGGGTCTACAGCACCGGCAGCAACGTGTTCCAGACCCGGGCCGGTTGCCTGATCGGCGCCGAGCACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCCGGCATCTGTGCCAGCTACCAGACCCAGACCAATTCACCCCGGAGGGCAAGGAGCGTGGCCAGCCAGAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACCGAGATTCTGCCCGTGAGCATGACCAAGACCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGACAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTGCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAACCGGGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAGGACAAGAACACCCAGGAGGTGTTCGCCCAGGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCTCCCATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAACTTCAGCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTAGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGACTGCCTCGGCGACATAGCCGCCCGGGACCTGATCTGCGCCCAGAAGTTCAACGGCCTGACCGTGCTGCCTCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCCCAGTACACCAGCGCCCTGTTAGCCGGAACCATCACCAGCGGCTGGACTTTCGGCGCTGGAGCCGCTCTGCAGATCCCCTTCGCCATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACAGCCTGAGCAGCACCGCTAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAGGACGTGGTGAACCAGAACGCCCAGGCCCTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAACTTCGGCGCCATCAGCAGCGTGCTGAACGACATCCTGAGCCGGCTGGACCCTCCCGAGGCCGAGGTGCAGATCGACCGGCTGATCACTGGCCGGCTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACCCAGCAGCTGATCCGGGCCGCCGAGATTCGGGCCAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGCCAGAGCAAGCGGGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTTCCCCAGAGCGCACCCCACGGAGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAGGAGAAGAACTTCACCACCGCCCCAGCCATCTGCCACGACGGCAAAGCCCACTTTCCTAGAGAAGGCGTGTTCGTGTCCAACGGCACCCATTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTCTACGAGCCCCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGTCTGGCAACTGCGACGTCGTGATCGGCATTGTGAACAATACCGTGTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAAGAGGAACTGGACAAGTACTTTAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGATATCAGCGGAATCAATGCCAGCGTCGTGAACATCCAGAAAGAGATCGACCGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAACTGGGGAAGTACGAGCAGTACATCAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTTATCGCCGGACTGATTGCCATCGTGATGGTCACAATCATGCTGTGTTGCATGACCAGCTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGTTGTAGCTGTGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGATTCTGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAAACTGCACTACACATGATGACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCCTGGAGCTAGCAAAAAAAAAAAAAGAAGAGCTCCAACCGGTGTGGTAGCTCCGCCGTTTAACATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAGATCCAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCACAGTCCCAAGGCTCATTTCAGGCCCCTCAGTCCTCACAGTCTGTTCATGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAATCCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAGATCGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAACATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAACTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCTAGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCCTCAGGTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATTAATACGACTCACTATAAGAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAGTGTGTGAACCTGACCACAAGAACACAGCTGCCTCCAGCCTACACCAACAGCGTTACCAGAGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGATCCAGCGTGCTGCACTCTACCCAGGACCTGTTCCTGCCTTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCTCCGGCACCAATGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGGGTGTACTTTGCCAGCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACACTGGACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAAGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGACGTCTACTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAAAGCGAGTTCCGGGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAGCATGGCAACTTCAAGAACCTGCGCGAGTTCGTGTTTAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATCAACCTCGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCTCTGCTCTGGAACCCCTGGTGGATCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCTGGCGATAGCAGCAGCGGATGGACAGCTGGTGCCGCCGCTTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGATTGTGCTCTGGATCCTCTGAGCGAGACAAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACCGTGGAAAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCTGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAAACGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAAGCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACAGGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAACAAGCCTTGTAACGGCGTGGCAGGCGTGAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTAGGCCCACATACGGCGTGGGCCACCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATCTCGTGAAGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGCGTGCTG

Zaujímavosťou je, že táto sekvencia vektora vakcíny Moderna má 99,8% identickú sekvenciu s plazmidmi objavenými vo vzorkách Pseudomonas aeruginosa, ktoré boli slávne upravené z NCBI po tom, ako v nich bola identifikovaná sekvencia spike proteínu. V tom čase sa viedla zdravá diskusia o tom, či tieto plazmidy zostanú vo vysokom počte kópií vo svojom hostiteľovi bez akéhokoľvek antibiotického selektívneho tlaku. Hĺbka pokrytia plazmidov obsahujúcich spike bola 10x nižšia ako čítanie pseudomonádového genómu, zatiaľ čo ostatné natívne pseudomonádové plazmidy mali 50x vyššie pokrytie ako pseudomonádový genóm. To ma viedlo k presvedčeniu, že tento plazmid obsahujúci hrot bol skôr kontamináciou počas procesu sekvenovania, pretože plazmidy s vysokým počtom kópií by mali mať vyšší počet kópií ako ich hostiteľské genómy, čo dokazujú natívne plazmidy pseudomonas prítomné v zostave. Táto otázka zostáva nedoriešená.

Neuvažoval som o tom, či pacienti v tejto pseudomonádovej štúdii boli očkovaní vakcínou obsahujúcou vysoké množstvo kontaminujúcich expresných plazmidov. Ako dlho sa tieto plazmidy replikujú v systémoch cicavcov bez selekcie Neo alebo Kan? Boli títo pacienti niekedy liečení takýmito antibiotikami v dôsledku ich pseudomonádovej infekcie? Fungovala by táto selekcia vzhľadom na to, že mnohé pseudomonas sú už natívne rezistentné voči Neo a Kan? Nedostatok verejnej transparentnosti týchto produktov bez zodpovednosti ponecháva mnoho otázok.

Obr. 8. Zarovnanie BLAST vektora Moderna s vektorom Pseudomonas

Expresný vektor spoločnosti Pfizer priradený k plazmidu s hrotom Pseudomonas aeruginosa.

Obr. 9. Analýza BLAST vektora Pfizer k vektoru Pseudomonas

EMA stanovila limity pre kontamináciu dsDNA na menej ako 330ng/mg RNA. To je približne 1 časť na 3,030 molekúl mRNA. Nie je jasné, ako stanovili tieto normy. Napríklad injekcia obsahujúca 34 biliónov mRNA s mierou kontaminácie plazmidmi 1 diel na 3,000 by sa rovnala viac ako 10 miliardám plazmidov rezistentných voči antibiotikám transfekovaných na pacienta. Dôkazy sekvenovania, ktoré máme teraz k dispozícii, potvrdzujú, že väčšina tejto DNA je v skutočnosti DNA expresného plazmidu s proteínom spike, promótormi expresie pre cicavce SV40, rezistenciou na aminoglykozidové antibiotiká a vysokými kópiami počiatkov replikácie, ktoré sú kompatibilné s expresiou pre cicavce aj s bakteriálnou amplifikáciou.

Rýchly odhad relatívneho pomeru nukleových kyselín vektora a vložených nukleových kyselín sa dá urobiť na základe maximálnej hĺbky pokrytia vložených nukleových kyselín v porovnaní s vektorom. Injekčná liekovka Moderna 2 má 739-násobné maximálne pokrytie oproti vektoru a 2,2 milióna X pokrytie oproti inzertu. To zodpovedá 1 vektoru na každých 3,000 mRNA.

Obr. 10. Analýza hĺbky čítania liekovky Moderna 2 pre sekvencie vektora a inzertu

Injekčné liekovky spoločnosti Pfizer majú rádovo vyššiu mieru kontaminácie. Je to v súlade s analýzou fragmentov, ktoré majú viac necieľových vrcholov.

Obr. 11. Analýza hĺbky čítania bivalentnej injekčnej liekovky 1 spoločnosti Pfizer

Keďže touto metódou sa meria DNA aj RNA, tieto odhady by sa mali potvrdiť pomocou qPCR s použitím DNázy a RNázy na spresnenie pomeru. Teraz, keď je vyššie uverejnená sekvencia kontaminujúcej nukleovej kyseliny, je možné tieto testy zostaviť a použiť na monitorovanie kontaminácie jednotlivých šarží.

Možno využiť informácie o vláknitosti v sekvenačných údajoch a rozlíšiť, ktoré časti zostavy pozostávajú z watsonových a crickových vlákien (DNA) a ktoré časti obsahujú prevažne crickové vlákna (zmyslové vlákna alebo mRNA). Môžete vidieť, že táto analýza presne určuje promótor T7 na báze 2200 vo vektore Moderna vial 1. To je jednoznačný dôkaz, že kontaminujúca sekvencia vektora je dvojvláknová DNA a nie RNA.

Obr. 12. Analýza hĺbky čítania Watson vs. Crick. Keď je pokrytie Crickovho vlákna mínus pokrytie Watsonovho vlákna = 0, máte DNA. Keď je nerovnováha, máte prevažne zmyslové vlákno mRNA

V dokumentoch EMA nie je uvedená účinnosť linearizácie tohto plazmidu, ktorá môže pomôcť obmedziť jeho schopnosť amplifikácie v hostiteľovi. Existuje mnoho lineárne amplifikovateľných plazmidov a v žiadnom prípade to nezaručuje rýchlejšie odstránenie plazmidu, ale mali by sa opísať metódy na zistenie účinnosti a dokončenia tohto kroku procesu výroby vakcíny.

Párové čítania v tejto štúdii môžu pomôcť odpovedať na túto otázku, keďže nami použitý assembler nebol naprogramovaný na hodnotenie cirkulárnosti kontigov.

Zvyškový templát DNA je nečistota súvisiaca s procesom, ktorá pochádza z linearizovaného templátu DNA pridaného do transkripčnej reakcie in vitro. Zvyškový templát DNA sa ďalej kontroluje rutinným testovaním pomocou analytického postupu opísaného v časti 3.2.S.4.2 Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia (qPCR) a špecifikácie liečivej látky BNT162b2 opísanej v časti 3.2.5.4.1 Špecifikácia. Výsledky sú uvedené v tabuľke S.3.2-1 pre doteraz vyrobené šarže na validáciu procesu

Tabuľka S.3.2-1 Výsledky testov zvyškovej DNA pre klinické šarže, šarže pre počiatočné núdzové zásobovanie a šarže pre kvalifikáciu výkonu procesu COVID-19 vakcína BNT162b2 liečivá látka (Andover)

Šarža 20YZ13C101 | 20YS13C201 | 20V513C301 | 20Y£13C401 | 20YE13CE01

Prijatie vzorky | Výsledky

Kritériá

Liečivá látka | 330 mg DNA | 17 3 10 bE) 211

RNA

Skratky: DNA = deoxynibonukleová kyselina; RNA = nbonukleová kyselina

Obr. 13. Pokyny EMA pre zvyškovú šablónu DNA nie sú splnené pri kontaminácii pozorovanej v sekvenovaných injekčných liekovkách spoločnosti Pfizer

Chyba transkripcie

Údaje zo sekvenovania presahujú pokrytie 1 milión X nad mRNA. Vertikálne farebné hash značky v sivých horizontálnych čítaniach (pod snímkou IGV) sú chyby. Tieto chyby môžu byť výsledkom viacerých faktorov.

Chybná inkorporácia polymerázy T7 pri syntéze mRNA vakcíny z expresných plazmidov, ktoré sa nachádzajú v kontaminácii týchto vakcín. Keďže v tomto kroku sa používa nukleotid m1Ψ náchylný na chyby, očakáva sa, že chyby pri transkripcii sa zvýšia o 200–300% (Chen et al.).
Reverzná transkriptáza použitá na premenu tejto modifikovanej mRNA na DNA pre sekvenovanie Illumina. Je známe, že tieto enzýmy RT sú náchylné na chyby (10^-4). Ich chybovosť sa pravdepodobne zvyšuje s použitím m1Ψ ako templátu.
Chyba PCR a sekvenovania. Tieto chyby sa dajú odhaliť a odstrániť odstránením duplicitných čítaní, optických duplikátov a filtrovaním kvality dát sekvenovania.

Bude zaujímavé sledovať chyby sekvenovania v chrbtici plazmidu DNA v porovnaní s chybami sekvenovania pozorovanými v proteíne hrotu, pretože by to pomohlo vyriešiť zdroj chyby. Chrbtica plazmidu je vernejšie replikovaná ako DNA a nikdy nebola odvodená z m1Ψ šablón mRNA, prejde 2 krokmi polymerázy s nízkou vernosťou nukleotidu (m1Ψ). Porovnanie chybovosti v chrbtici plazmidu s chybovosťou v transkribovanej oblasti plazmidu by pomohlo konkretizovať chybovosť vyvolanú použitím nukleotidu náchylného na chyby.

Vzhľadom na vysokú hĺbku pokrytia sa budúca práca zameria na filtrovanie Q30 (1 chyba na 10^3) všetkých čítaní s cieľom odstrániť chyby, ktoré by mohol zaviesť sekvenátor, a opätovne posúdiť, či je možné odhaliť transkripčnú chybu bez UMI.

Obr. 14. Čítania mapované späť do zostavy Megahit z injekčnej liekovky 1 bivalentnej vakcíny Moderna

Obr. 15. Čítania mapované späť do zostavy Megahit poskytujú dva haplotypy pre spike proteín. Wuhan-1 a Omicron sa líšia natoľko, že asembler rozdeľuje tieto sekvencie proteínu Spike na dva kontigy

Na prieskum chybovosti transkripcie, ktorej frekvencia sa odhaduje na 1:3,000–4,000, ktorú opísal Chen a kol. sa často vyžadujú jedinečné molekulárne identifikátory (UMI).

Obr. 16. Zobrazenie UMI pre čítania s opravou chýb

Táto práca bola vykonaná na stanovenie základnej sekvencie pre bivalentné vakcíny a nebola navrhnutá s UMI. V budúcej práci sa to môže preskúmať.

Diskusia

Kontaminácia dvojvláknovej DNA (dsDNA) v týchto vakcínach je významným problémom. Agentúra EMA stanovila limity dsDNA v týchto vakcínach pod 0,33% (330pg/mg). To je približne 1 molekula DNA na 3,000 molekúl mRNA. Zatiaľ čo vakcíny Moderna túto špecifikáciu spĺňajú, vakcíny Pfizer majú 10-krát vyššiu kontamináciu s 1 molekulou DNA na 350 mRNA. To je 1 replikačne kompetentný plazmid na 350 molekúl mRNA a rovná sa miliardám plazmidov odolných voči antibiotikám, ktoré sa vstreknú na osobu na jednu injekciu.

Existujú artefakty pri konštrukcii knižnice, ktoré môžu skresliť hodnotenie transkripčnej chyby. m1Ψ je známy tým, že zdržuje polymerázy a vyvoláva vyššiu mieru polymerázovej chyby. To môže umožniť účinnejšiu syntézu prvého vlákna z plazmidovej DNA v porovnaní s modifikovanou RNA. Takáto vysoká miera inhibície polymerázy by však vyvolala otázky týkajúce sa vernosti transkripcie pomocou m1Ψ.

EMA mala dobrý dôvod sledovať hladiny dsDNA vo vakcínach. Injekcie dsDNA môžu u cicavcov vyvolať reakcie interferónu typu I prostredníctvom STING. Ak sú tieto dsDNA zabalené do LNP, môžu transfekovať a transformovať bunky cicavcov aj baktérií v mikrobióme pacientov. Nie je jasné, ako sa agentúra EMA rozhodla pre prijateľnú kontamináciu dsDNA a či zvážila kontaminujúcu DNA, ktorá je schopná amplifikácie vo vnútri hostiteľa.

Vektory obsahujú cicavčie promótory, bakteriálne počiatky replikácie a gény rezistencie voči neomycínu a kanamycínu. Takéto kruhové plazmidy sa používajú na stabilnú transfekciu a pokračujúcu expresiu génov v bunkách cicavcov so silným promótorom SV40. To by mohlo viesť k predĺženej expresii hrotu u pacientov, ktorým boli tieto konštrukty aplikované. Baktérie transformované týmito plazmidmi by sa replikovali 50–300 kópií plazmidu na bunku. Nie je známe, či by baktérie exprimovali aj spike proteín v týchto plazmidoch, ale prítomnosť promótorov T7 v niektorých vektoroch naznačuje, že je to pravdepodobné.

Použitie neomycínu alebo kanamycínu pacientom po očkovaní týmito plazmidmi by mohlo umožniť selekciu baktérií rezistentných na neomycín a kanamycín v črevnom mikrobióme. Nie je jasné, či sa proteín hrotu v týchto expresných vektoroch exprimuje v baktériách. Napriek tomu by očkovanie miliárd ľudí plazmidmi s dvojitou rezistenciou voči antibiotikám a vysokým počtom kópií mohlo byť krokom späť v našom boji proti rezistencii voči antibiotikám. Transformujú tieto expresné vektory črevný mikrobióm? Koľko kópií expresných plazmidových vektorov pre cicavce sa replikuje po transfekcii vakcíny?

Arkmedic sa zaoberá štúdiou biodistribúcie, ktorá dokazuje lokalizáciu LNP v hrubom čreve za 48 hodín. Aj keď sa 1% LNP lokalizuje v čreve, baktérie by mohli tieto plazmidy amplifikovať na oveľa vyššie úrovne vzhľadom na vysoký pôvod replikácie kópií vo vektoroch. Zatiaľ čo LNP sú účinnejšie pri transfekcii bunkových membrán cicavcov ako bunkových stien baktérií, väčšina E.coli sa ľahko transformuje pri 37°C s holou DNA. Pacienti s horúčkami zlepšia účinnosť transformácie.

Jessica Rose poznamenala (osobná komunikácia), že v popise je viac ako 40 podaní pacientov na VAERS s neomycínom alebo kanamycínom. Toto číslo je ťažké dať do kontextu, pretože nie všetky predloženia VAERS obsahujú užívanie antibiotík obetí.

Súhrnne možno konštatovať, že existuje nedostatok verejných informácií o vernosti sekvencie a čistote nukleových kyselín použitých v týchto vakcínach. Podľa našich vedomostí ide o prvé hĺbkové sekvenovanie týchto produktov a prvýkrát boli vo vakcínach objavené expresné plazmidy. Ide o silné kontaminanty vo vakcínach, ktoré sa podávajú deťom. Miliardy týchto kontaminantov na injekciu sú pravdepodobne podhodnoteným odhadom ich celkovej záťaže, keďže tieto plazmidy sa môžu samoreplikovať v bakteriálnych hostiteľoch. Viaceré štúdie preukázali predĺžený klírens mRNA vakcín. Môže to byť dôsledok m1Ψ v mRNA alebo transfekcie či transformácie expresných vektorov na báze DNA. Zavedenie miliárd génov rezistencie voči antibiotikám v plazmidoch s vysokým počtom kópií schopných replikácie by malo vyvolať obavy z urýchlenia globálnej rezistencie voči antibiotikám.

Poďakovanie

Chcel by som poďakovať Jessice Rose, Sabine Hazan, Jikkyleaks, @pathogenetics, Steve Massey, Valentine Bruttel , Lynn Fynn, Sasha Latypova a Pharmacoconuts za užitočné pripomienky k tejto téme. Tieto údaje by sa mali považovať za návrhy zostáv. Je potrebná ďalšia práca na rozdelení haplotypov Omicron a Wuhan-1 a spresnenie odhadov lineárnej a cirkulárnej DNA, ktorá je prítomná vo vakcínach. Analýza chybovosti a artefaktov sekvenovania na pozadí sa môže ďalej spresniť prostredníctvom úsilia komunity. Neváhajte a zanechajte pripomienky nižšie.

preklad: Kisutumo Midonotaka –> https://tinyurl.com/yxxk3y9a

Údaje zo sekvenovania

Nespracované čítania Illumina

Čítané súbory sa preženú cez sha256 (Hash and stash) a zapíšu sa do blockchainu DASH. Hash SHA256 čítaného súboru sa strávi do OP_RETURN nemennej účtovnej knihy. Ak sa hash súboru nezhoduje s hashom v týchto transakciách, so súborom bolo manipulované.